人猴痘（MPX）是一种罕见的人畜共患传染病，表现为独特的天花样体征和症状。近年来，MPX在欧洲及其他地区的复苏对人类构成了潜在威胁。尽管猴痘病毒（MPXV）感染人类后病情相对温和，死亡率较低，且天花疫苗已被证实对MPXV具有85%的保护效果，两种抗天花病毒药物亦获批准用于MPXV治疗，但针对MPXV感染的特定疫苗和药物仍处于空白。因此，研究并制定控制和预防MPXV传播的策略显得尤为重要，其中构建适用于MPXV研究的模型即是关键环节之一。

文章介绍

年10月12日，来自荷兰的KarineRaymond团队在期刊NatureMicrobiology（IF:28.）发表了一篇题为“Mpoxvirusinfectionanddrugtreatmentmodelledinhumanskinorganoids”的论文。

在这项研究中，研究人员证明了人诱导多能干细胞（iPSC）衍生皮肤类器官可用作研究猴痘病毒感染和药物治疗的可靠实验模型。他们发现，早期使用抗病毒药物特考韦瑞（tecovirimat）能有效抑制感染性病毒的产生，并防止宿主转录组重配。

#1

摘要

Abstract

猴痘病毒（Mpoxvirus，MPXV）主要感染人类皮肤，导致病变。目前，还缺乏能再现皮肤受MPXV感染的强大模型。本研究证明了人类诱导多能干细胞衍生的皮肤类器官易受MPXV感染并支持感染性病毒的产生。角质形成细胞是皮肤上皮的主要细胞类型，可有效支持MPXV感染。细胞内病毒颗粒组装呈现四个阶段：新月形病毒颗粒形成、未成熟病毒颗粒、成熟病毒颗粒和包裹病毒颗粒。转录分析表明，MPXV感染会重构宿主转录组，并引发病毒转录本的大量表达。这项研究确立了人类皮肤类器官作为研究MPXV感染、绘制病毒-宿主相互作用图谱和测试疗法的可靠实验模型的地位。

#2

研究方法

Methods

1.类器官培养和感染：研究使用人工诱导多能干细胞（hiPSCs）培育皮肤类器官，然后将这些器官暴露于MPXV，观察病毒感染的情况。

2.组织学分析：通过对培养的皮肤类器官进行组织学分析，包括HE染色和免疫荧光染色，以观察病毒感染后细胞和组织的变化。

3.药物处理：研究测试了抗病毒药物特考韦瑞对MPXV感染的影响，包括早期和晚期处理，以评估药物对感染的抑制效果。

4.显微镜观察：利用共聚焦显微镜和透射电镜等技术，观察病毒感染和药物处理后的细胞和组织变化，以及病毒颗粒的组装和释放过程。

#3

主要结果

Results

早期皮肤类器官中的MPXV感染

首先，研究人员使用了分化55天的皮肤类器官进行初步测试，发现在感染后7天，细胞内病毒基因组拷贝数增加了3log10，而细胞外分泌到培养基中的病毒DNA水平也持续增加，最高峰达到了约9log10copies/mL。同时，感染后7天，细胞内和细胞外的病毒滴度也都显著增加。研究人员还通过免疫染色和透射电镜观察到了病毒在角质形成细胞中的复制和组装过程，进一步证实了MPXV对皮肤类器官的感染和复制过程。

图1早期人类皮肤类器官中的MPXV感染。

a，分化55天时人类皮肤类器官的明场图像。比例尺，μm。b，类器官中病毒DNA水平的定量分析。每个图代表来自单个类器官的病毒DNA（1小时组n?=?4，7天组n?=?6）。c，定量培养基中的病毒DNA水平（对于第1系，感染后1小时时n?=?4，感染后第1天至7天时n?=?3；对于第2系，感染后1小时时n?=?5感染，感染后第1天至第7天，n?=?4）。d，培养基中分泌病毒的感染性病毒滴度的定量（第1行，n=3；第2行，感染后1小时至3天，n=4，感染后第4天至7天）。e，通过使用KRT5（白色）、KRT15（绿色）和病毒复制中间dsRNA（红色）和DAPI核染色（蓝色）的抗体进行免疫染色，对MPXV感染的类器官的代表性可视化。比例尺，25μm。f，具有代表性的透射电镜显示了类器官中的未成熟病毒颗粒（IV）。比例尺，1μm和nm（放大倍数）。g，代表性TEM可视化类器官中的主要成熟病毒颗粒（MV）。比例尺，1μm，nm和nm（放大倍数）。h，TEM可视化MPXV组装的中间步骤。比例尺，1μm和nm（放大倍数）。绿色框表示含有病毒质的病毒工厂的一部分。h，接种后一小时，接种后每天。

晚期和末期皮肤类器官中的MPXV感染

研究人员使用分化90天和天的皮肤类器官中感染MPXV的结果。他们发现，经过90天分化的类器官模型具有分层的上皮组织结构，外层表达丝聚蛋白(FLG)和兜甲蛋白(Loricrin)，并形成明显的毛囊。感染后7天与感染后1小时相比，细胞内和细胞外病毒基因组拷贝数增加了约3log10，分泌的病毒的感染力也显著增加。在分化天的皮肤类器官中可见完全形成的毛囊，接种MPXV后，通过分别量化1小时至7天的类器官和培养基中的病毒DNA，他们观察到病毒在类器官中的强劲复制（增加3log10）和分泌到培养基中（增加2log10）。这些结果显示，在这些不同发育阶段的皮肤类器官中，病毒基因组拷贝数和病毒滴度均随感染时间的延长而显著增加。

图2晚期人类皮肤类器官中的MPXV感染。

a，分化90天后的人类皮肤类器官的明场图像。比例尺，μm。b，类器官中病毒DNA水平的定量分析。每个图代表来自单个类器官的病毒DNA（n=4）。c，培养基中病毒DNA水平的定量分析。每个图代表病毒DNA从一个独立的培养基与单一培养的类器官（n=6）。d，培养基中分泌病毒的感染性病毒滴度的定量（n=3）。e，通过KRT5（绿色）、病毒dsRNA（红色）和DAPI核染色（蓝色）整体染色，以及z-堆栈采集和投影，实现角质形成细胞中MPXV的代表性可视化。比例尺，μm。f，e中区域的放大视图（黄框）。比例尺，μm。g，从整个z堆栈中分离出来的单个光学平面上的一个区域的代表性放大图像，显示在单个KRT5阳性细胞中存在dsRNA。比例尺，50μm。h，通过共染色KRT5（绿色）和病毒dsRNA（红色）在冷冻切片中对MPXV进行代表性可视化。比例尺，50μm。i，代表性TEM可视化类器官（特别是角质形成细胞）中的MPXV病毒体。比例尺，2个μm，1个μm和nm。

图3终末期人类皮肤类器官中的MPXV感染。

a，分化天时皮肤类器官的明场图像。比例尺，μm。b，类器官中病毒DNA水平的定量分析。每个图代表来自单个类器官的病毒DNA（n=3）。c，培养基中病毒DNA水平的定量分析（n=6）。d，培养基中分泌病毒的感染性病毒滴度的定量（n=6）。e，使用抗上皮标记整合素β4亚基的抗体（红色）、抗MPXV病毒体的抗体（绿色）和DAPI细胞核染色（蓝色）进行整体免疫染色，得到皮肤类器官中MPXV的代表性图像。比例尺，μm。f，通过免疫染色整合素β4亚基（红色）和MPXV（绿色）以及DAPI细胞核染色（蓝色）获得的全贴装皮肤类器官的单z平面光学切片中MPXV的代表性图像。比例尺，50μm。g，代表性透射电镜显示类器官中细胞内4个MPXV病毒颗粒（新月形、未成熟病毒颗粒（IV）、成熟病毒颗粒（MV）和包裹病毒颗粒（WV））（黑色箭头表示细胞降解晚期；红色框架表示病毒质形成/进入IV）；绿色框架表示病毒工厂的纤维方面。比例尺，纳米。h，透射电镜显示角质形成细胞中的MPXV病毒颗粒。比例尺，2个μm，1个μm和nm。

录组分析揭示了MPXV与宿主之间活跃的相互作用

研究人员对感染MPXV的90天皮肤类器官进行了转录组分析，发现在接种后7天，大量病毒转录本映射到MPXV参考基因组的不同位置，而在接种后1小时则几乎没有病毒基因表达。基因本体分析确定了与免疫应答、自噬和抗病毒应答相关的上调通路，而一些与皮肤相关的通路，如皮肤发育和角化作用，显著下调，表明感染扰乱了类器官中的皮肤稳态。个别基因分析揭示了重要的上皮细胞来源的细胞因子如胸腺基质淋巴瘤细胞因子（TSLP）和白细胞介素-36γ（IL36G）在接种后7天上调。这些数据共同表明，MPXV感染会导致角质形成细胞扰动，并可能影响类器官模型中皮肤的屏障功能。早期使用抗病毒药物特考韦瑞可以有效抑制感染和防止宿主转录组的重构。

图4MPXV感染的类器官的转录组分析。

a，MPXV转录物映射到病毒基因组中的位置。b，热图显示了（推定的）病毒转录本在不同时间点以及接种后接受特考韦瑞治疗的表达水平。P值由Benjamini-Hochberg调整。c，不同组的PCA，每组三个重复（对照：未感染的类器官；感染后1小时和7天收集的接种MPXV的类器官；感染后7天用特考韦瑞治疗的类器官）。d，与未感染组相比，接种后第7天的基因本体分析显示通路受到显着调节。红色：上调；蓝色：下调。P值由DESeq2确定。e，与皮肤上皮细胞相关的选定基因的mRNA表达水平的RNA测序分析。皮肤类器官未感染（对照）、接种后1小时（1小时感染）、感染7天（7天感染）或感染并用5μM特考韦瑞治疗7天（7天感染?+特考韦瑞治疗），每组n?=?3。mRNA水平表示为每百万映射读取中每千碱基转录物的片段(FKPM)。

图5MPXV-宿主相互作用和对特考韦瑞治疗的反应。

a，早期特考韦瑞治疗皮肤类器官的示意图。b,c，特考韦瑞治疗后96小时(b)和7天(c)时培养基中MPXVDNA水平的定量（b中，每组n?=?4；c中，无治疗组n?=?6，n对于替考维马组=?4）。d，特考韦瑞治疗后7天培养基中感染滴度的定量。治疗组中检测不到感染性病毒滴度（n?=?4）。e，特考韦瑞治疗后7天后类器官中MPXVDNA水平的定量（n?=?4）。f，不同组类器官中映射的MPXV转录本的百分比（n?=?3，P??0.）。g，MPXV感染后显着调节的前50个基因。h，皮肤类器官中特考韦瑞延迟治疗的示意图。i,j，培养后1小时（0天）、2天、4天、6天、8天、10天、12天和14天时培养基中MPXVDNA水平(i)和感染滴度(j)的定量-接种。接种后4天施用特考韦瑞(1μM)。数据显示为平均值±s.e.m。在i中，对于MPXV传播，n?=?10，对于未治疗组和特考韦瑞治疗组，n?=?5。在j中，每组n?=?5。b、c、e、i和j使用双尾Mann-Whitney检验；f采用χ2检验。*P??0.05（对于i，P?=?0.），**P??0.01（对于j，P?=?0.）。虚线表示感染滴度不可检测。

特考韦瑞对ALI培养的皮肤类器官中的MPXV有抑制作用

研究人员采用气-液界面（ALI）系统培养的皮肤类器官中感染MPXV，并使用特考韦瑞进行抑制实验。结果显示，特考韦瑞处理组的培养基中MPXV的DNA水平显著低于未处理组，表明特考韦瑞可以有效抑制MPXV的复制。此外，在特考韦瑞处理组中，感染后7天的培养基中未检测到感染性病毒，而未处理组中的感染性病毒水平显著高于特考韦瑞处理组。

组织学染色和免疫染色显示，ALI培养的皮肤类器官的分层结构与人类皮肤的基底层（KRT5）、棘层（KRT10）和颗粒层（LOR）标记的表达非常相似。病毒颗粒在感染的ALI培养的皮肤类器官的表皮层和真皮层中被检测到。透射电镜分析显示了典型的与皮肤相关的特征。以上结果说明特考韦瑞对ALI培养的皮肤类器官中的MPXV有抑制作用。

图6ALI培养的皮肤类器官中的MPXV感染和抗病毒治疗。

a，ALI培养的类器官中MPXV感染和治疗的示意图。b，经过特考韦瑞处理或未经处理的类器官培养基中MPXVDNA水平的定量（n?=?6，P?=?0.）。c，接种后1小时至7天培养基中感染性病毒滴度的动力学（n=7）。d，特考韦瑞治疗后7天培养基中感染性病毒滴度的定量。治疗组中检测不到感染性病毒滴度（n?=?7）。e，特考韦瑞治疗后7天后皮肤类器官中病毒DNA水平的定量（n?=?3）。f，用HE染色的ALI皮肤类器官的代表性明场图像。比例尺，50μm。g，使用针对上皮层标记物KRT5（基底层）、KRT10（棘层）和LOR（颗粒层）以及针对MPXV病毒颗粒、病毒复制dsRNA或整联蛋白β4亚基的抗体进行的代表性免疫染色。比例尺，?μm。h，代表性TEM图像可视化皮肤相关标志和MPXV病毒体（蓝框显示形成未成熟病毒体的过程）。比例尺，2μm、nm和nm（放大倍数）。i，代表性TEM图像显示了ALI皮肤类器官中不同的MPXV病毒体。比例尺，?nm。数据显示为生物重复的平均值±s.e.m，**P0.01，曼-惠特尼检验，双尾。IV、未成熟病毒颗粒；MV，成熟病毒颗粒；WV，包裹病毒颗粒。

#4

总结

Suggestion

研究人员采用构建的皮肤类器官，探讨了猴痘病毒（MPXV）在皮肤中的发病机制，并对其抗病毒药物进行了评估。研究结果显示，该皮肤类器官具备支持猴痘病毒有效感染的能力，感染过程导致大量猴痘病毒转录本的表达，并对宿主转录组产生影响。此外，天花治疗药物——特考韦瑞能够抑制感染性猴痘病毒颗粒的生成，表明该皮肤类器官模型系统在探究病毒与宿主相互作用及抗病毒药物测试方面具有巨大潜力。综合考虑，此研究为MPXV皮肤发病机制的研究以及抗病毒药物的筛选开发提供了一种高效的iPSC衍生皮肤类器官模型。

参考信息

LiP,PachisST,XuG,SchraauwenR,IncittiR,deVriesAC,BrunoMJ,PeppelenboschMP,AlamI,RaymondK,PanQ.Mpoxvirusinfectionanddrugtreatmentmodelledinhumanskinorganoids.NatMicrobiol.Nov;8(11):-.doi:10./s---6.EpubOct12.PMID:.

本文来源：类器官学社